佑佰生物
uniBac
常見問題
COMMON PROBLEM
佑佰生物采用的昆蟲細胞轉染方法和轉染試劑是什么？
佑佰生物進行昆蟲細胞轉染時， qBac?-III或qBac?-IIIG的區別是什么？
佑佰生物如何選擇合適的感染復數（multiplicity of infection， MOI）來開展實驗？
佑佰生物進行昆蟲細胞轉染時，采用的bacmid是什么產品？
佑佰生物進行轉染后，為什么還需要進行感染？
佑佰生物如何測定病毒滴度？
佑佰生物采用的bacmid中，qBac?-III具有蛋白高產的特性，能夠大量表達目的蛋白（達到300mg/L-5g/L）。qBac?-IIIG在qBac?-III的基礎上引入GFP作為可視化的熒光標記，有利于我們和客戶更好地觀測桿狀病毒的復制過程，同時擁有更高的蛋白產量。然而GFP在某些領域擁有嚴格的管控，建議客戶審慎采用qBac?-IIIG。若客戶不介意GFP作為雜蛋白的引入，作為可視化的熒光標記，GFP可以為試驗過程提供更細致的檢驗點，從而精準的控制和評價試驗。需要強調的是，GFP和重組蛋白是獨立表達的，重組蛋白通常采用強啟動子（polh promoter或p10 promoter）來確保重組蛋白的高產，而GFP采用的是弱啟動子，故不會干擾重組蛋白的表達。
佑佰生物嘗試了多款性能優越的轉染試劑，因昆蟲細胞具有其特殊之處，目前我們采用FuGENE? HD 轉染試劑（Catalog number: E2311），來實現標準化的高效率轉染。
感染復數（multiplicity of infection， MOI）=病毒數量/細胞數量。佑佰生物通常采用MOI=0.05-0.1來進行桿狀病毒的增殖，采用MOI=3-5來進行重組蛋白的表達。桿狀病毒增殖過程中采用低MOI，從而避免大量病毒基因組之間發生同源重組導致缺陷型病毒的產生；重組蛋白表達過程中采用高MOI，從而實現重組蛋白的大量表達。
佑佰生物采用的bacmid是qBac?-III或qBac?-IIIG，利用這些產品包裝出的桿狀病毒，能夠獲得更高的滴度（通常不低于1×10^8 PFU/ml），同時表達出更多的重組蛋白。
轉染是為了將帶有客戶目的基因的重組載體質粒和bacmid共轉染入昆蟲細胞，利用昆蟲細胞自身的重組系統來包裝出具有感染性的桿狀病毒。隨著桿狀病毒的復制，我們會收獲P0代桿狀病毒。然而因目的基因差異和細胞狀態差異等因素，這個步驟很難達到100%的轉染效率，收獲的桿狀病毒滴度往往不能達到最佳水平。通過隨后進行的感染實驗大量繁殖桿狀病毒，使其達到足夠高的滴度和足夠大的體積，保證后續實驗的順利開展。
病毒滴度一般分為物理滴度和感染滴度（生物滴度）。物理滴度是指包含病毒基因組的病毒顆粒濃度，通常利用實時定量PCR來測定；感染滴度是指具有感染性的病毒粒子濃度，通常用TCID50法來測定。物理滴度側重檢測病毒基因組的拷貝數，感染滴度側重檢測病毒粒子的感染性。物理滴度通常高于感染滴度。
|
|