佑佰生物
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常見問題
COMMON PROBLEM
基因合成中需要考慮Kozak序列嗎？
佑佰生物提供哪些蛋白表達(dá)的策略？
分泌表達(dá)蛋白的策略有利于后期純化，那為什么要采用胞內(nèi)表達(dá)的策略？
載體構(gòu)建中需要考慮移碼突變嗎？
分泌表達(dá)蛋白一定要用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒的信號肽嗎？
推薦將目的基因整合到哪個穿梭載體上？
目的基因如何整合到穿梭載體上？
密碼子優(yōu)化是必需的嗎？密碼子優(yōu)化能否增加蛋白的可溶性？
佑佰生物目前提供兩類蛋白表達(dá)的策略，分別適用于重組蛋白的胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)。
真核生物表達(dá)蛋白，均需要考慮Kozak序列，它可以與翻譯起始因子結(jié)合從而介導(dǎo)含有5’帽子結(jié)構(gòu)的mRNA翻譯起始，故Kozak序列在真核生物mRNA的翻譯過程中至關(guān)重要。
佑佰生物采用的qBac?昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，能夠大量表達(dá)重組蛋白。蛋白的分泌有特定的途徑和過程，在特定的蛋白收取時機(jī)下，可能還有大量的蛋白由于未完成分泌過程而滯留于細(xì)胞內(nèi)，這種情況下收取細(xì)胞內(nèi)的蛋白可以獲得更高的蛋白得率。另外，有些蛋白一旦分泌到培養(yǎng)基中，可能不利于其自身活性的維持和自組裝活性的表現(xiàn)，這類蛋白也建議采用胞內(nèi)表達(dá)的策略。
為了確保重組蛋白的正確表達(dá)，載體構(gòu)建中應(yīng)避免移碼突變，移碼突變會導(dǎo)致表達(dá)失敗。佑佰生物的工程師會協(xié)助客戶制定載體構(gòu)建策略，佑佰生物采用的載體質(zhì)粒已經(jīng)過優(yōu)化以避免移碼突變，所以客戶只需選取限制性酶切位點(diǎn)即可，無需過分擔(dān)憂移碼突變風(fēng)險(xiǎn)。
通常情況下，昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中采用gp64/gp67的信號肽來實(shí)現(xiàn)重組蛋白的分泌，另外，蜂毒蛋白和蠶絲蛋白的信號肽也具有類似用途。信號肽不僅可以促進(jìn)蛋白的分泌，也有利于蛋白的折疊，有些時候蛋白自身的信號肽也可以應(yīng)用于昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，即使蛋白來源于人或其他哺乳動物。
佑佰生物通常會根據(jù)客戶需求進(jìn)行評估，根據(jù)蛋白的特性及后期具體應(yīng)用場景，推薦合適的穿梭載體給用戶。穿梭載體的選擇詳見：pQB?系列轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。(https://bacmid.com/index.php?id=plasmid)
佑佰生物通常利用無縫克隆/同源重組的方式，將目的基因整合至穿梭載體上。
在重組蛋白表達(dá)中，通常需要根據(jù)物種的密碼子偏好性進(jìn)行序列優(yōu)化，密碼子優(yōu)化通常被用來提高蛋白的表達(dá)水平。密碼子優(yōu)化能夠賦予重組蛋白更高的表達(dá)量，但不能明顯促進(jìn)重組蛋白的可溶性。大部分時候，密碼子優(yōu)化能夠顯著提升重組蛋白的表達(dá)量，但也有密碼子優(yōu)化導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)量降低（甚至不表達(dá)）的案例。我們建議，審慎地進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在盡量維持重組蛋白活性的前提下，通過密碼子優(yōu)化來獲得更高產(chǎn)量的重組蛋白。
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西安佑佰生物科技有限公司
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